家禽常用生物制品合理使用-第23章
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1％鸡红细胞悬液的配制：采集2～3只SPF公鸡或无禽流感和新城疫等抗体的健康公鸡血液，与等体积阿氏液混合，用pH值7。2的0。01摩/升磷酸盐缓冲液洗涤3次，每次洗涤后均以3 000转/分离心5分钟，之后用磷酸盐缓冲液配成1％红细胞悬液，置于2℃～8℃条件下保存备用。
抗原溶解：冻干的抗原和血清均按瓶签上标注的量，用磷酸盐缓冲液溶解。
【血凝试验及结果判定】 在 V 形微量反应板中，每孔加0。025毫升磷酸盐缓冲液。第一孔加0。025毫升抗原，反复抽打3～5次混匀。从第一孔吸取0。025毫升抗原加入第二孔，混匀后吸取0。025毫升加入第三孔，如此进行对倍稀释至第十一孔，从第十一孔吸取0。025毫升弃去。每孔加0。025毫升磷酸盐缓冲液和0。025毫升1％鸡红细胞悬液。将反应板在振荡器上震荡1～2分钟或轻扣反应板混合反应物，在室温（20℃～25℃）下静置20～30分钟或在2℃～8℃条件下静置45～60分钟。在对照孔红细胞显著呈纽扣状时判定结果。结果判定时将反应板倾斜60°，观察红细胞有无泪珠状流淌，完全无泪珠样流淌（100％凝集）的最高稀释倍数为血凝效价。
【血凝抑制试验及结果判定】 根据血凝试验测定的效价，计算配制4个血凝单位（4HAU）抗原。血凝效价除以4即为含4个血凝单位抗原的稀释倍数。例如，血凝效价为1 ∶ 256，则4个血凝单位抗原的稀释倍数应是1 ∶ 64（256除以4）。第一至第十一孔加入0。025毫升磷酸盐缓冲液，第十二孔加入0。05毫升磷酸盐缓冲液。第一孔加入0。025毫升血清，充分混匀后吸0。025毫升于第二孔，依次倍比稀释至第十孔，从第十孔吸取0。025 毫升弃去。第一至第十一孔均加入0。025毫升4HAU抗原，在室温（20℃～25℃）下静置30分钟或在2℃～8℃条件下静置50分钟。每孔加入0。025 毫升 1％鸡红细胞悬液，振荡混匀，在室温（20℃～25℃）下静置20～30分钟或在2℃～8℃条件下静置45～60分钟，对照红细胞将呈明显的纽扣状沉于孔底。
以完全抑制4HAU抗原的最高血清稀释倍数判为该血清的血凝抑制效价。当阳性对照血清的血凝抑制效价与已知效价误差不超过1个滴度、阴性对照血清效价不高于21og2 时，试验方可成立。被检血清血凝抑制效价≤31og2判为阴性；=41og2判为可疑（可疑样品应重检，重检效价≥41og2 判为阳性，≤31og2 判为阴性）；≥51og2判为阳性。
【注意事项】 ①影响血凝和血凝抑制试验的因素很多，应严格控制试验条件。每加一份试剂或样品后需更换吸头，同时应严格控制作用温度和时间。②准确配制红细胞悬液，使用时应随时振摇。③用pH值7～7。2的磷酸盐缓冲液作为稀释液。④抗原和阴性、阳性血清若有污染应废弃。⑤准确配制4HAU抗原，使用前需进行滴定，滴定好的抗原应在2小时内用完。⑥抗原和血清按规定方法保存。冻干试剂应按规定的体积用磷酸盐缓冲液溶解，溶解后置于2℃～8℃条件下保存不得超过1个月，可分装成小包装，在…70℃条件下冻存，随用随取，但切忌反复冻融。⑦鸭、鹅以及哺乳动物的血清一般需进行非特异性凝集和抑制素的处理。⑧同一亚型不同毒株的血凝抑制试验抗原，若抗原性存在差异，则检测同一血清的血凝抑制效价不同。⑨剩余的试剂及空瓶不能随意丢弃，须经加热或消毒灭菌后方可废弃。
【贮藏与有效期】 血清在…15℃以下条件下保存，有效期为24个月。抗原在4℃条件下保存，有效期为12个月。
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三、鸡白痢、鸡伤寒多价染色平板抗原与阳性血清（）
【制备方法】 本抗原系用标准型和变异型鸡白痢、鸡伤寒沙门氏菌各1株，分别接种于适宜培养基培养，培养物用含2％甲醛溶液的磷酸盐缓冲盐水制成菌液，用乙醇处理，加结晶紫乙醇溶液和甘油制成。用于诊断鸡白痢和鸡伤寒。阳性血清系用标准型和变异型鸡白痢、鸡伤寒沙门氏菌制成的灭活抗原，分别免疫健康羊或家兔，采血提取血清，用国家标准血清标化后，经冷冻真空干燥制成，供全血平板凝集试验对照用。
【物理性状】 本品为紫色的混悬液体，静置后菌体下沉，经振荡后呈均匀的悬浮液。将本品滴于平板，2分钟内不应有自凝颗粒出现。
【无菌检验】 依法检验，应无菌生长。
【抗原效价测定】 在平板上分两处各滴抗原1滴，每滴为0。05毫升。然后分别滴上标准型血清和变异型血清各0。05毫升（均含0。5单位），混合后在2分钟之内出现不低于50％凝集者为合格。
【非特异性检验】 在平板上滴抗原1滴，然后再滴阴性血清1滴，混合后不应出现凝集。
【作用与用途】 供诊断鸡白痢、鸡伤寒用，适用于产蛋母鸡及3月龄以上的鸡。
【用法与判定】 用滴管吸取抗原，垂直滴于玻板上1滴（相当于0。05毫升），然后用针刺破鸡的肱静脉或冠尖，取血液0。05毫升与抗原混合均匀，并涂散至直径约2厘米的液面，2分钟内判定结果。发生50％（＋＋）以上凝集者为阳性，不发生凝集者为阴性，介于上述两者之间则判为可疑。
【注意事项】 ①同时应设强阳性、弱阳性、阴性血清3个对照（各1滴），分别滴加抗原1滴，混匀，在2分钟内，强阳性血清应出现100％凝集，弱阳性血清出现50％凝集，阴性血清不凝集。②平板凝集试验应在20℃以上环境中进行。
【贮藏与有效期】 在2℃～8℃条件下保存，冻干血清有效期为4年，稀释好的强阳性血清和弱阳性血清有效期为1 年。在…15℃以下条件下保存，冻干血清有效期为8年。
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四、鸡败血支原体血清平板凝集试验抗原与阴性、阳性血清（Ⅱ）（）
【主要成分】 本品用抗原性良好的鸡败血支原体制成。
【物理性状】 本品为红色均匀悬浮液体，静置后菌体下沉，振荡后呈均匀悬液，无凝集块或颗粒。
【作用与用途】 用于诊断鸡败血支原体感染。
【用法与判定】 用22号针头在洁净检测板上滴加2滴抗原（约0。025毫升），然后取等量血清与之混合均匀，并涂散成直径约2厘米的液面，2分钟内判定结果。出现明显凝集颗粒或凝集块者为阳性，不出现凝集者为阴性，介于两者之间则判为可疑。
【注意事项】 ①用前将抗原振荡混匀，待检血清不能冻结。②试验应在20℃左右条件中进行。③试验所用的一切材料应保持清洁无污染。
【贮藏与有效期】 在2℃～8℃条件下保存，有效期为3年。阳性血清在2℃～8℃条件下保存，有效期为2年6个月。
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五、禽流感病毒7亚型血凝抑制试验抗原与阴性、阳性血清（）
【主要成分】 抗原为灭活的 H7 亚型禽流感病毒，血凝效价≥7log2。阳性血清为SPF鸡感染禽流感病毒H5亚型制备的高免血清，血凝抑制效价≥7log2。阴性血清为SPF鸡血清。
【物理性状】 抗原为白色或淡黄色海绵状疏松团块，阳性血清和阴性血清为微黄色或淡红色海绵状疏松团块，易与瓶壁脱离，加稀释液后迅速溶解。
【作用与用途】 用于血凝抑制试验检测禽流感病毒H7亚型抗体。
【用法与判定】 同禽流感病毒H5亚型血凝抑制试验抗原与阴性、阳性血清。
【注意事项】 同禽流感病毒H5亚型血凝抑制试验抗原与阴性、阳性血清。
【贮藏与有效期】 同禽流感病毒H5亚型血凝抑制试验抗原与阴性、阳性血清。
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六、禽流感病毒9亚型血凝抑制试验抗原与阴性、阳性血清（）
【主要成分】 抗原为灭活的 H9 亚型禽流感病毒，血凝效价≥7log2。阳性血清为SPF鸡感染禽流感病毒H9亚型制备的高免血清，血凝抑制效价≥7log2。阴性血清为SPF鸡血清。
【物理性状】 抗原为白色或淡黄色海绵状疏松团块，阳性血清和阴性血清为微黄色或淡红色海绵状疏松团块，易与瓶壁脱离，加稀释液后迅速溶解。
【作用与用途】 用于血凝抑制试验检测禽流感病毒H9亚型抗体。
【用法与判定】 同禽流感病毒H5亚型血凝抑制试验抗原与阴性、阳性血清。
【贮藏与有效期】 同禽流感病毒H5亚型血凝抑制试验抗原与阴性、阳性血清。
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（一）微生态制剂的概念（）
微生态制剂兴起于20世纪70年代，被认为只有活的微生物才能起到微生态的平衡作用，因此认定微生态制剂是活菌制剂，甚至有一段时间，有人曾把微生态制剂称为活菌制剂。活菌制剂是指在动物胃肠道微生态理论指导下，运用微生态学原理，利用对宿主有益无害的正常微生物经特殊工艺制成的活的微生物饲料添加剂，动物食入后，其能在消化道中生长、发育或繁殖，并起到有益作用。
活菌制剂能通过改进肠道微生物平衡对动物施加有益影响。在我国，人们经常称其为益生菌或微生态制剂。美国食品与药物管理局（FDA）1989年将其名称规定为“直接饲喂微生物”（Direct？fed microbial，DFM）。加拿大称之为“活的微生物产品”（Viable microbial products，VMP）。在日本，其被称为“有效微生物”（Ef？fective microbial，EM）。但随着科学研究的深入和微生态制剂的不断发展，大量资料证实，死菌体、菌体成分、代谢产物也具有调整微生态失调的功效。
微生态制剂是根据微生态学的微生态平衡、微生态失调、微生态营养和微生态防治等理论，利用正常生物菌群成员或其促进物质制成的能够调整机体微生态平衡的物质。广义上的微生态制剂按组成成分的不同分为益生素、益生元和合生元三大类。益生素是指有利于宿主肠道微生物平衡的活菌食品或饲料添加剂，目前用作饲料添加剂的微生物主要有乳酸菌、芽孢杆菌、酵母菌、放线菌和光合细菌等几大类。益生元是指能选择性的刺激宿主动物消化道内有益菌生长或产生对动物有利的营养物质或消化饲料中的不可消化成分的有效物质，包括低聚糖、微藻、双歧因子、酸化剂、中草药、糖萜素及天然植物等。合生元即为益生素和益生元按一定比例混合后的产物，具有两者的协同促进作用。狭义的微生态制剂多指益生素，这是由于益生素的保健功能更具兼容性，既能在一定程度上达到有益生元的作用效果，又有自身的微生态学效应特性。
微生态制剂是无毒、无污染的环保产品，已广泛应用于畜牧、水产养殖业中。
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（二）微生态制剂的作用机制及应用范围（）
微生态制剂进入动物体内主要通过一些物质的生成和对肠道微生物区系的改变而发挥作用，其作用机制相当复杂，而且其理论研究进展还比较慢，确切机制尚未被完全解读。一般认为，动物微生态制剂进入畜禽肠道内，与其中极其复杂的微生态环境中的正常菌群会合，会出现栖生、互生、偏生、竞争或吞噬等多种复杂关系。
1。 恢复优势菌群，维持动物肠道菌群平衡
正常情况下，动物消化道内的有益微生物维持着动态的平衡，以促进动物生长和饲料的消化与吸收，但当动物机体受到某些应激因素影响时，这种平衡可能被破坏，导致消化道内微生物区系紊乱，病原菌大量繁殖，引起动物消化功能失调、腹泻等病理状态，生长受阻。合理添加微生态制剂，可人为增加肠道内有益菌的数量，使其在较短时间内占据优势地位，保持肠道菌群的平衡，对有害菌起到很好的拮抗作用。
2。 生物屏障作用
正常微生物区系构成动物机体的防御屏障，其中包括生物学屏障和化学屏障，微生态群有序地定植于黏膜、皮肤等的表面或细胞间形成的生物膜样结构上，形成一层生物膜，封闭了致病菌的侵入门户，起着占位争夺营养、互利互生等生物共生或拮抗作用。
3。 产生多种活性物质，发挥多种功效
益生菌能产生多种有益的代谢产物，产生各种酶类（蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、纤维素酶等），这些酶类在消化过程中与体内的酶起到协同作用，有利于降解饲料中的蛋白质、脂肪和复杂的碳水化合物，提高饲料转化率。有些益生菌也能合成营养物质，如维生素、氨基酸、未知促生长因子等，这些营养物质参与机体的新陈代谢，促进动物生长。还有些益生菌能产酸，可有效降低肠道pH值。乳酸菌进入肠道后产生乳酸，芽孢杆菌进入动物
